色谱分析法基本理论

  仪器分析色谱分析法基本理论，对照PPT制作。色谱分析法是以试样各组分在固定相和流动相间的吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据，而建立起来的各种物理或物理化学分离分析方法。

  以试样各组分在固定相和流动相间的吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据，而建立起来的各种物理或物理化学分离分析方法。

  将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不一样的颜色的色带，使各色素成分得到了分离。 这种分离方法被命名为色谱法(chromatography)。

  分离效率高；分析速度快；检验测试灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化。

  利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法

  利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法

  利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或分子排阻色谱法

  在色谱发展史上占有主体地位的是：英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格) 他们发明液-液分配色谱；提出色谱塔板理论；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。 1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。

  1952年Martin和James A T发明气相色谱法; 1956年范第姆特(Van Deemter)等人发表了描述色谱过程的速率理论; 1956年Go1ay提出了开管柱色谱理论; 20世纪60年代推出气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)；70年代高效液相色谱法(HPLC)迅速崛起 ; 20世纪80年代相继出现液相色谱的各种联用技术；还诞生了超临界流体色谱(SFC)；80年代末毛细管电泳法(CE)飞速发展。

  该过程主要利用试样中各组分在固定相和流动相间具有不一样的溶解和解析能力；或不同的吸附和脱附能力；或其它亲和性能的差异

  试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线，或色谱图。

  即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 W=4 =1.699W1/2

  tR实际上是组分在固定相中保留的总时间，包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间。

  不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。

  测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即 ū = L/t0

  某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR = tR  t0

  指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： VR= tR FC

  指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速FC（cm3·min-1）计算。 V0 = t0FC

  某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保 留体积。 VR= VR  V0 = tR FC

  两组分调整保留值的比值，称为相对保留值，也可以是分配系数、保留因子之比。 r2,1= tR2/ tR1= K2 / K1=k2 / k1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速等无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。

  保留指数把物质的保留行为用邻近其的两个正构烷烃来标定，并以均一标度表示。I只与固定相和温度有关，只要两者保持相同，在任何仪器及相同液相制备的任何柱上，在相同温度测得的I应相同。 在GC中又称Kovasts指数，已推广到HPLC，采用正构烷基苯为标准物。

  样品组分分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。

  它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=Cs / Cm

  在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比，又称分配比、容量因子，其表达式为：

  在色谱柱一定时，Vs、Vm一定，若温度、流速一定，则t0一定，此时tR（VR）仅取决于保留因子k或分配系数K。组分的K越大，k值也大，在柱中滞留时间长，较晚流出色谱柱。

  在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在两相间浓度的比值K为常数(K= Cs/ Cm ),由此绘制的Cs-Cm关系曲线应为一条直线，称为等温线，如图中曲线a所示。

  线性等温线为K固定不变时得到的理想等温线，对应的色谱峰为正常峰（对称峰）。但在实际分析中，完全对称的色谱峰很少，一般只能得到非线性等温线，如图中曲线b或曲线c所示，曲线b为凸形等温线，产生拖尾峰；曲线c为凹形等温线，产生前延峰。

  色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须充足远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。

  图中KAKB ，因此，A组分在移动过程中滞后。 若要使A、B组分完全分离，一定要满足以下三点： 第一，两组分的分配系数必须有差异； 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度； 第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。

  第一、二点是完全分离的必要条件。 作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种各样的因素。 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。

  把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。

  (ii)以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积(ΔVm)。

  (iii)所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴(纵)向扩散可忽略。

  简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。每层塔板的高度（或每达到一次分配平衡所需的柱长）称为理论塔板高度(height equivalent to a theoretical plate)，用H表示。溶质平衡的次数则为理论塔板数(number plate)，用n表示 。

  对于一根长为L的色谱柱，将理论塔板高度H定义为单位柱长的方差，即：溶质平衡的次数即理论塔板数n应为： n = L / H与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。

  n与半峰宽及峰底宽的关系式为：从公式能看出，在tR 一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。

  当色谱柱长度一定时，塔板数 n越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

  不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

  柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

  塔板理论无法解释谱带展宽的原因；无法解释柱效与流动相流速的关系；也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

  贡献：用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数

  局限：色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关。

  式中u为流动相的线速度；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。

  涡流扩散 原因：柱填充不均匀A=2dpA：涡流扩散系数，其单位为cm。：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径，dp小，A小；但dp太小， 和柱阻大。

  原因：浓度差组分向“塞子”前后扩散，使区带展宽。影响因素：u ， B=2DmB：纵向扩散系数，其单位为cm2/s。：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。 Dm：组分在流动相中的扩散系数。

  传质阻力系数C包括流动相传质阻抗系数Cm和固定相传质阻抗系数Cs两项，即 C = Cm+ Cs 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。

  流动相传质过程是指试样组分从流动相移动到固定相表面的过程。对于填充柱，流动相传质阻力系数Cm为： Cm= fm (k) dp2 / Dm 由上式看出， Cm与dp2成正比，与Dm成反比。 因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的流动相，可使Cm减小，提高柱效。

  固定相传质过程是指试样组分从固定相表面移动到固定液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回界面的传质过程。固定相传质阻力系数 Cs为： Cs = q  k / (1 + k)2  df2 / Ds 由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在固定相的扩散系数Ds大，则固定相相传质阻力就小。 一般都会采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。虽然提高柱温可增大Ds，但会使k值减小，为了保持适当的Cs值，应控制适宜的柱温。

  根据Van Deemter方程分别作LC和GC的H-u图，LC(a)和GC(b)的H-u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点。

  LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多。

  LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。

  柱温变化对色谱过程分子扩散和传质的影响是矛盾的： 柱温升高，Dm、Ds增大，纵向扩散使柱效降低；而改善传质使柱效提高。 应根据色谱系统性质，判断引起色谱峰扩张的重要的因素是分子扩散或传质，选择正真适合柱温。

  n、k、α对分离度的影响如图所示，增大n，使峰变窄而改善分离度，tR不变；增加k，分离度增加，但峰变宽且tR增大；提高α，分离选择性增加，峰间距增大，明显提高分离度。因此，要获得满意的分离度，就需要提高n、α及k，一般是通过选择适宜的固定相、流动相、柱温、流速等条件，使混合物各组分在尽可能短的时间内获得良好的分离(R1.5)。

  既可用气相色谱、也可用高效液相色谱分析的试样，通常首选气相色谱，以降低分析成本。

  在相同的固定相和操作条件下，分别测出已知物和未知物的保留值。两者吻合则可判断未知组分可能是该已知物。

  定量依据：在一定操作条件下，被分析物质的重量mi与检测器上产生的信号（峰面积或峰高）成正比。

  原因：各物质在同一检测器上响应不同或同一物质在不同检测器上响应不同mi＝fi´×Ai 或 mi＝fi´×hi

  i — 样品，s — 标准物[GC：苯(TCD)；正庚烷(FID)] 将其它物质峰面积都校正成相当于这个标准物的峰面积。然后用校正的峰面积来计算物质的含量。

  前提：样品中所有组分都能流出柱且对检测器都有响应，同时已知各组分的fi。

  如果样品中各组分的相对校正因子相近（如同系物）或只是粗略定量时，可约去校正因子，直接用峰面积归一化计算，称为不加校正因子的面积归一化法。计算公式为：

  前提条件：工作曲线线性良好、过原点配一与被测组分含量接近的标样，分别进样。

  优点：不需内标物，又具有内标法的优点，与进样量无关，只要两次进样实验条件恒定即可，非常适合于低浓度多组分样品的定量分析。

  精密度 包含重复性、中间精密度和重现性。重复性要求平均含量的RSD≤3%。

  准确度 一般用加样回收试验，要求回收率在95%～105%，RSD3%（生物样品除外）。