第四章色谱分析仪器与技术ppt

  一、数据处理系统 1. 积分仪 主要有模拟和数字积分仪两种类型。基本功能是得出色谱图上的峰面积。 积分仪可以准确地计算出峰面积，为定量分析打下基础。 2. 色谱工作站 硬件是指信号采集单元，将色谱仪输出的电压信号转变为电脑可接受的离散数字信号，起着电脑与色谱仪之间的接口转换作用。 软件部分主要有系统软件、控制软件、采样软件和各种数据处理软件包；接受色谱信号数据，提供人机窗口界面，对色谱图进行各种处理的参与仪器的自动控制的计算机程序集。 一、数据处理系统 数字积分仪 二、计算机在色谱仪中的功能 1.分析信息处理 ①峰的处理；②计算峰高；③峰面积积分。 2.数据演算功能 进行总和校正、成分比率、移动平均、线性多项式演算等数据计算。 3.程序控制功能 实现程序升温、程序变流速、梯度洗脱、程序变压、阀门切换、流路切换、衰减程序、大气压平衡等一系列程序操作，自动控制色谱工作过程中的操作条件。 二、计算机在色谱仪中的功能 4.存储器的保存功能 内部电池支撑内存保存、磁盘内数据的输入和输出。 5.自动标定功能 自动标定保留时间、死时间、峰高等基本信息参数。 6.异常检出和显示功能 异常检出功能对信息处理器进行自检，以保证数据处理的准确性。一旦检测出异常工作情况，微机即给出提示信息，报警并自动关闭仪器。 7.外部输出功能 ①记录器输出各种图；②数据计算机输出并打印记录；③报警输出并自动停机。 第五节 色谱仪在临床实验室的应用 一、气相色谱仪在临床实验室的应用 人体微量元素的测定； 血与尿等体液中各种化合物的测定； 人体代谢产物的分析； 药物的组成和含量分析与鉴定。 气相色谱仪和质谱仪的联用技术能分析百余种违禁药品。 二、高效液相色谱仪在临床实验室的应用 1.激素水平测定 区分内源性、外源性胰岛素，研究胰岛素的构型变化。 2.治疗药物监测 抗癫痫类、抗忧郁类、治疗心血管病、巴比妥类、免疫抑制剂、抗肿瘤药物等。 高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用技术等成为常用的治疗药物浓度分析方法。 3. 生物胺的检测 高效液相色谱-质谱联用技术检验测试血浆、尿液或组织中儿茶酚胺类物质浓度的变化，用于协助诊断高血压、嗜铬细胞瘤等疾病。 高效液相色谱法分析组胺可作为过敏性疾病诊断的一项辅助性指标。 二、高效液相色谱仪在临床实验室的应用 4. 其他生化指标的测定 （1）高效液相色谱法分析红细胞膜磷脂成分的变化，为预防糖尿病血管并发症、糖尿病的治疗监测提供必要的辅助诊断参考。 （2）离子交换高效液相色谱法是测定HbA1c的标准方法。 （3）用高效液相色谱法测定血浆总胆固醇、脂蛋白能有很大成效避免其他甾醇对测定结果的干扰。 （4）用反相高效液相色谱法可分离白血病细胞和慢性粒细胞性白血病细胞中的差异蛋白，对白血病的诊断有一定的帮助；高效液相色谱法还可测定恶性血液病患者血液中的假尿嘧啶核苷，对恶性血液病的诊断有一定价值。 主要差别： （1）操作条件差别 （2）进样方式差别 （3）检测器差别 （4）流动相差别 （5）分析对象差别 本章小结 色谱法可对多组分混合物样品进行分离分析。 样品进入色谱仪后经流动相冲洗到达固定相，由于不同样品中的组分在流动相和固定相中的分配系数不同，实现样品的分离。 色谱仪最常用的有气相色谱仪（GC）和高效液相色谱仪（HPLC）两类。 GC具有高分辨率、高速度、高灵敏度及选择性好等优点，但要求样品也必须为气态。 常用的监测器有热导检测器、氢火焰离子化检测器等。 HPLC检测的样品为液态，操作基本上可以在室温的条件下完成，更适合自然状态下大多数样品的分析。常用的监测器有紫外及可见光检测器、二极管阵列检测器等。 Thank you ! 六、气相色谱仪的工作原理 气态样品或经气化室气化了的液态样品被载气（流动相）带入色谱柱（固定相）。在色谱柱中经过多次反复吸附—脱附—析出的分配过程后，依次离开色谱柱，进入检测器；检测器把流入的组分定量的转换成电信号，经放大处理后，送往显示与记录系统，从而得到被测样品各个组分的色谱图。 柱参数的合理选择影响分离效果，柱参数就是有关色谱操作的所有参数的统称。 气相色谱仪的流程图 六、气相色谱仪的工作原理 气相色谱仪的参数选择 1.色谱柱和填料 所有新色谱柱使用前必须经老化处理以除去填料中的污染物和减轻对检测器的污染。 2.色谱柱长 选择柱长的依据是分离度和分离速度。 3.载气流速 以兼顾灵敏度和分辨率为出发点。 六、气相色谱仪的工作原理 气相色谱仪的参数选择 4.进样器和检测器的温度 温度比恒温箱最高温度高出25～50℃，防止样品组分冷凝。 5.恒温操作 温度一般要求比样品最高沸点低40℃左右。 原则是温度每上升1℃，保留时间缩短5%。温度每上升30℃，分配系数下降一半，分析速度加快一倍。 6.程序操作 ，常用线性升温。 第三节 高效液相色谱仪 第三节 高效液相色谱仪HPLC 废液 分离柱 检测器 数据处理器 进样装置 温控装置 流量控制器 梯度装置 高压泵 记录仪 脱气装置 储液槽 高效液相色谱仪主要由溶剂输送系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、温度控制管理系统、检测系统和数据处理与显示系统等构成。 一、溶剂输送系统 溶剂输送系统应具备宽的流速范围和入口压力范围，并能适用于所有的溶剂。 溶剂输送系统主要由液源（储液槽）、脱气装置、高压输液泵、流量控制器和梯度洗脱装置等构成。 其中： 储液槽是装溶剂的容器，一定要能容纳色谱连续工作所需要的较大量的溶剂。 脱气装置大多数都用在除去溶解在溶剂中的空气和其他气体。 一、溶剂输送系统 （一）高压输液泵 作用： 将洗脱液连续不断地送入分离柱以完成色谱分离过程，其性能对分离和检测均有很明显的影响。 分类： 恒压泵，常用的有直接气动泵和气动放大泵等； 恒流泵，最常用的高压泵是机械往复式柱塞泵。 出 口 入 口 单 向 阀 液缸 柱塞 凸轮 机械往复式柱塞泵示意图 第三节 高效液相色谱仪 一、溶剂输送系统 （二）梯度洗脱及洗脱方式 等度洗脱（isocratic elution） 在样品的分离过程中从始至终采用相同的流动相和相同的流量来完成样品分离。 梯度洗脱（gradient elution） 在色谱的分离过程中，把两种或更多的不同极性互溶的洗脱液随时间按某种变化的比例混合，使流入色谱柱的洗脱液组成作连续的改变，目的是让样品的每一个组分都在最佳分配系数的条件下分离出来，以获得较好的峰形。（内外梯度） K = 化合物在固定相中的溶解浓度 化合物在流动相中的溶解浓度 K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。 等度洗脱： 对于一些复杂样品各组分的 K值对任意一种流动相都分布很宽时，分配比小的先出色谱柱，但往往分离不好，甚至不能完全分离。而最后出来的若干组分因时间太长，峰形扩散，致使检测器的灵敏度明显降低，甚至无法检出。解决此问题可用下列措施： 1.程序升温（气相） 2.组合柱 3.梯度洗脱 （最常用） 内： 改变流量 外：改变流动相组成 一、溶剂输送系统 （三）流量控制器 柱反压 高压的流动相流经色谱柱时，与固定相产生相互作用，形成与流动相流动方向相反的作用力，即构成一个与流向相反的压力，称为柱反压，它阻碍流动相的正常流动。 流量控制器的作用是防止过高的色谱柱反压对分离造成不好影响。 二、进样系统 高效液相色谱仪进样系统的要求是能将样品有效地注入到系统里去，且不破坏在色谱柱和检测器里所建立的流量平衡。 理想的进样系统应能给系统带来最低限度的死体积，否则柱效率将受到损失。 进样装置有多种，包括注射器、多通进样阀和自动进样器。 二、进样系统 （一）注射器 直接注射器进样 进样时注射器直接插入色谱柱上端的进样器隔膜，将样品注入到色谱柱中固定相的顶端，可在不停流情况下进样。针头可顶到色谱柱口，因而死体积小，峰扩展小，有利于分离，但进样量重复性差。 隔断式注射器进样 隔断式进样器是在不进样时用隔断器将进样系统与流动相隔断开，进样时将隔断器提起，让进样系统与流动相连通，将注射器针头插到色谱柱顶端进样。流动相带着样品进入色谱柱，进样完毕马上关闭隔断器。 二、进样系统 导向头 亚硝基氟橡胶密封圈 隔断式注射进样器 洗脱液 色谱柱 二、进样系统 （二）高压进样阀 四通阀、六通阀等，承受高压的能力和密封性要求更严格。 常用的是旋转式六通阀。进样量准确、重复性好是旋转式六通阀的最大优点，其缺点是死体积较大，峰的扩展也较注射器严重。一般适于在高压条件下且样品量较大时的自动进样。 开始分析 废液 样品 淋洗液 至分离柱 进样阀 样品 装样 废液 淋洗液 至分离柱 （ＬＯＡＤ） （ＩＮＪＥＣＴ） 样品环 定量环进样 三、分离系统和温度控制管理系统 （一）柱管材料、几何形状和尺寸 1.材料 色谱柱管的材料有不锈钢、厚壁玻璃和石英。工作所承受的压力超过3.92MPa时，必须用不锈钢管柱。 2.形状 柱管的形状有直管柱和螺旋柱。现在大多数都采用直管柱。 3.尺寸 柱长和内径是由实际需要的分离度、压力降、分析时间以及样品量的大小综合决定的。要求柱管内壁经抛光处理，内径上下一致，以免引起流量变化。装柱时将柱内固定相上、下面与密封过滤片接触面顶紧，以免出现柱头下陷，影响柱效。 三、分离系统和温度控制管理系统 凝胶过滤色谱柱 不锈钢色谱柱 亲和层系色谱柱 厚壁玻璃色谱柱 三、分离系统和温度控制管理系统 （二）固定相和流动相 选择适当的流动相，可使分离效果得到一定的改善。 正确选择流动相的根本原则： ①稳定性好，柱效率长期不变。 ②适应所采用的检测器。 ③能溶解待分离样品。 ④清洗方便。 ⑤粘度要小一些。 三、分离系统和温度控制管理系统 （二）固定相和流动相 1.液固吸附色谱法固定相 是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，吸附剂大部分以硅胶为基体。 2.液液分配色谱法 在载体（担体）上涂敷一层固定液作为固定相。 正向分离：用极性固定液和非极性流动相来分析极性化合物的色谱系统。 反向分离：指用非极性固定液和极性流动相来分析非极性化合物的色谱系统。 液－液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液 涂渍了固定液的载体 1－流动相；2－固定液液膜；3－毛细深孔和渗入的固定液； 4－液固界面；5－液液界面 三、分离系统和温度控制管理系统 （三）温度控制管理系统 控温装置是通过对恒温箱的温度控制来实现对色谱柱的温度控制； 一般都采用闭环负反馈的温度控制方式； 将色谱柱连同整个检测系统均放在恒温箱内，使之保持大致相同的温度，可得到较好效果。 第三节 高效液相色谱仪 四、检测器 （一）基本要求和分类 1.对流动相的适应 如果流动相的特性参数与待分离物中某一组分相同，或者多元流动相对同一原理的检测器具有不一样的参数值，都会使检测器无法正常工作。 2.峰扩展 由于流动相的流速相对较慢，峰扩展的问题更为突出，要求检测器的空间及测量系统的时间常数尽可能小。 四、检测器 （二）常用检测器 总体型检测器 保持溶质在溶剂中，即流动相加已分离组分立即进入检测器检测，即对洗脱液和组分总体的物理性质（如折光率、电导率等）进行仔细的检测，如示差折光检测器、紫外-可见光检测器、微量吸附热检测器等。 溶质型检测器 把从色谱柱流出物的溶质和溶剂分开，让溶质单独进入检测器，如热导检测器、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器等。 四、检测器 紫外-可见光检测器 结构与紫外-可见分光光度计基本相同。 高效液相色谱仪中最常用的检测器。 具有灵敏度和检测精度高、线性范围宽、受流量和温度波动的影响小、适用于梯度洗脱及不破坏样品等特点 一种选择性检测器，但是只能用于在工作波长范围内有吸收的样品。 2.二极管阵列检测器 先让所有波长的光都通过流动池，然后通过后分光技术，使所有波长的光在接受器上被检出。 相当于与紫外联用；色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，可提供组分的定性信息。 四、检测器 3.示差折光检测器 主要由光源系统、光路系统、接收、放大、记录系统组成。 通过检验测试折射率的变化，达到分析样品各组分的目的。 灵敏度较低，不适合做痕量分析。也不适合梯度洗脱。 4.荧光检测器 荧光检测器是用紫外光照射样品，通过光电倍增管检测样品所发出的荧光，记录色谱图。 荧光检测器又分为多波长荧光检测器和荧光分光检测器。 荧光检测器在选择性和灵敏度方面优于紫外检测器，是选择性检测器，被检样品一定要能被激发出荧光。 检测器的主要性能 性能/检测器 紫外 荧光 折光 安培 电导（二极管） 测量参数 吸光度 荧光强度 折射率 电流 电导率 类型 选择性 选择性 通用 选择性 选择性 池体积 1～10 3～20 3～10 ﹤1 1 噪声/测量参数单位 10-4 10-3 10-7 10-9 10-3 最小检测浓度/g/mL 10-10 10-11 10-7 10-12 103 线 温度影响 小 小 大 大 大 流速影响 无 无 有 有 有 可否用于梯度洗脱 能 能 不能 不能 不能 对样品有无破性 无 无 无 无 无 五、操作条件的选择 1.流动相的流量 提高流量可以缩短分析时间，但会降低分离度，增加柱压。 分析时常常选则10 ml/min以下流量。制备时流量可大一些。 2.柱温 高效液相色谱仪的工作一般在室温下进行。一般不通过调整柱温来提高分离能力。 3.压力 高压可提高分析速度。一般可在3.43～34.32MPa之间选取，最高不能超过49.03MPa。 4.进样量 高效液相色谱仪注重的是分析速度及分离能力，极小的进样量有利于这两项指标。 第四节 色谱仪的数据处理系统 第四章色谱分析仪器与技术 谢国明 重点提示 1.色谱法的基础原理是什么？ 2.色谱法的分类和特点是什么？ 3.色谱分析的常用术语和参数有哪些？ 4.气相色谱仪的基本结构是怎样的？ 5.气相色谱仪常用的检测器有哪些？ 6.高效液相色谱仪的构造和工作原理是什么？ 7.高效液相色谱仪常用的检测器有哪些？ 目 录 第一节?色谱法的原理与分类 第二节 气相色谱仪 第三节 高效液相色谱仪 第四节 色谱仪的数据处理系统 第五节 色谱仪在临床实验室的应用 第一节? 色谱法的原理与分类 一、色谱法的基础原理 色谱分离中的两相:固定相和流动相 色谱法利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离。 色谱分离的两要素是互不相溶的两相以及样品各组分在两相中分配的差异。 这是决定色谱最终分离结果好坏的基础。 色谱工作就是使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用（分配、吸附、离子交换等） 。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测的新方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm） 一、色谱法的基础原理 色谱分离原理示意图 样品1 样品2 样品3 响应R 2 进样峰 时间（t） 1 3 色谱柱（固定相） 流 动 相 1 1 2 2 2 3 3 3 3 二、色谱法的分类与特点 （一）色谱法的分类 按流动相和固定相物理状态分类：气/液相、气液/固 按所利用的物理化学原理分类：吸附、分配、离子交换 按操作形式分类：柱、纸、薄层、棒 按色谱动力学过程分类：冲洗、顶替 （二）色谱法的特点 应用场景范围广、样品用量少、选择性高、效能高和灵敏度较高。 三、色谱分析的常用术语和参数 色谱图 检测器响应R 基线 b 空气峰a 进样峰h 1 2 3 时间t(min) tRa tR1 tR2 tR3 进样峰 三、色谱分析的常用术语和参数 1.色谱图 色谱分离分析过程中，所记录的检测器响应信号随时间变化的曲线.基线 表明纯流动相流过检测器时所产生的响应，反映了检测器噪声随

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