色谱方法及仪器的发展

  1。允许进样量大，但分离组分仍然以相当高的纯度获 得高产率 2。各个组分在分离过程中形成较清晰的界限，消除了 洗脱分析中的拖尾，提高了样品的回收率。

  置换剂选择是成功分离和纯化目标组分的重要的条件。置换剂应该 • 在固定相和流动相上的分配系数大于所有被分离的各个组分的 分配系数 • 有良好的化学稳定性，不与样品中的任何组分有化学反应。 • 于流动相中有良好溶解度，能快速完成再生 • 易于和被分离的组分分离 • 无毒无害，符合药品食品法规要求；高效廉价。

  • 式中，u0为流动相线速度、uD为置换剂线速度、qD为置换剂在固 定相中的浓度、CD为置换剂在流动相中的浓度。

  • 当操作线的斜率小于被分离组分分配等温线的斜率时， 组分才能被置换色谱展开。

  置换色谱法的操作原理 • 图示是在理想情况下（无 纵向扩散和化学反应）得 到的置换色谱图。被分离 组分得到一个矩形平台 （plateau）洗脱峰。这时 各个组分以置换剂的速度 等速移动，达到等速状态 （isotachic conditions ） • uD=u1 =u2 =u3 =u4 • 由上两个式子得

  样品处理包括纯化、冷凝、热吸附、热气提、空气取样、固相萃取、固相 微萃取、超临界流体萃取、样品制备等。

  一般，液相色谱固定相都可以用作固相萃取剂。但是用作固相萃取剂的填料 粒度较大。大多数是使用碱性硅胶基填料。大致有如下性质

  平均粒度：40—50μm；平均孔径：50—70Å；总孔体积：0.9m3/g；

  物质更强，因而适用为置换剂)不同研究表明：中低分子量的 置换剂更好[32] 。因为，即使置换剂与被分离产物蛋白质有叠 加，在后处理中低分子量置换剂较容易从目标产物中除去； 其次色谱柱再生更快；成本更低。

  酸戊聚糖（Mw3000）、或硫酸葡聚糖（Mw50 000）做置换剂 ；用海藻多糖类物质（也是食品添加剂无毒副作用）—褐藻酸

  • • • • • • （14）乙酸酐——（AA） （15）三氟乙酸酐——（TFAA） （16）五氟丙酸酐——（PFPA） （17）七氟丁酸酐——（HFBA） （18）N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑——（MBTFA） （19）1-(三氟乙酰)咪唑——（TFAI）

  组分5、6的分配等温线起始断地斜率小于操纵线斜率因而没有被 置换，而以洗脱方式得到高斯色谱峰。说明操作线控制了各个 组分的的移动速度、流出浓度、洗脱体积。 • 操作线与样品组分分配等温线的交点所对应的在流动相中的浓 度就是样品各个组分的流出浓度。流出组分的浓度随置换剂浓 度增加而增加（操作线斜率减小）。与各个组分在样品中的原 始浓度没有必然的联系。 • 各个组分在样品中的原始浓度以及进样量的大小决定了平衡时 各个组分在置换系列中谱带的宽度。因此，只要确定了置换剂 的浓度和流速，就可以预测各个组分置换洗脱液的体积、浓度 和洗脱时间。 • 置换剂的浓度既控制了产物的浓度，也控制了整个色谱运行的 速度。

  • • • • • • • • • • • • • （1） 双（三甲基硅烷基）乙酰胺——（BSA） （2） N,O二（三甲基硅烷）乙酰胺——（BSA） （3） 双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺——（BSTFA） （4） 二甲基二氧硅烷——（DMDCS） （5） 六甲基二硅胺——（HMDS） （6） 1,1,1,3,3,3六甲基硅氮烷——（HMDS） （ 7 ） N-( 叔 丁 基 二 甲 基 硅 烷 基 )-N- 甲 基 三 氟 乙 酰 胺 —— ( MTBSTFA ) （8） N-甲基三氟乙酰胺——( MTBSTFA ) （9） 三氟乙酸——（TFA） （10）三甲基氯硅烷——（TMCS） （11）三甲基硅烷咪唑——（TMSI） （12）二甲基二氯硅烷——（DMDCS） （13）N-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺——（）

  使用时尚需注意的性质： 粒度分布、表面pH值、表面金属浓度（可以用适当的酸洗降低） 一般制备固相萃取管时，注意使用合适的滤膜——聚乙烯、聚四氟乙烯、不锈 钢等

  1．硅胶填料(键合及非键合相)，2．氧化铝填料(酸性、碱性、中性)，3．硅 酸镁-Florisil 填料，4．石墨类填料(石墨化碳黑)，5．聚合物树脂填料

  (1) 对样品组分进行化学衍生的意义 ① 扩大组分间色谱行为的差别, 获得良好的分离.或者 缩短分析时间. ②将原来的活泼基团(如羟基、羰基等)转化成非活性或 弱活性基团, 减少色谱峰的了拖尾 ③利用某些衍生物在特定检测器上有更高的灵敏度, 获 得更好的定量. ④根据组分生成衍生物前后的色谱行为来帮助对组分进 行定性分析.

  其中，q表示达到置换平衡时 组分在固定相中的浓度、 C是流动相中的浓度，用 脚标识别组分

  例1：分离小分子生物样品（如氨基酸、肽、抗生素和胰岛素等） 用反相色谱做置换分离时，常用的置换剂有疏水物质有：2(2-丁氧基)乙醇(BEE)、癸基-三甲基溴化銨、十六烷基-三甲 基溴化銨、苄基-二甲基-十二烷基溴化銨、辛基-十二烷基-二 烷基氯化銨、棕榈酸等。 例2：分离生物大分子样品的置换色谱，多离子型的置换剂与离 子交换填料相结合是目前常用的分离方法。-与传统认识(认为分子量大的聚电解质对固定相的结合比被分离

  • 用置换色谱分离的样品组分与固定相之间的分配最好符合 Langmuir 分配等温式。置换剂在固定相上的分配系数应大于所 有被分离组分在固定相上的分配系数。将置换剂和各个被分离 组分的分配等温线作图，可见置换剂的分配等温线在所有被分 离组分的上方。若操作线为直线如图。 • 根据物料平衡方程，置换剂在色谱柱中的移动速度为

  置换色谱实质上是一种非线性色谱技术。操作程序 包括色谱柱上的分配平衡、上样、加置换剂、洗脱、 分步收集、色谱柱再生等过程。 • 由于各个组分在固定相上的竞争分配，分配系数大 的组分置换分配系数小的组分，并推动分配系数小 的组分沿柱长方向挪动。系统达到分配平衡后，样 品中各个组分按照其分配系数K的大小形成系列色谱 区带（称为色谱置换序列 displament train），最终使 样品各个组分分离。 • 在置换剂推动下样品各个组分依次流出色谱柱。 • 色谱柱进行再生，准备进行下一次置换分离操作。

  6。一旦找到比较合适的分离条件，样品中各个组分的浓度 在分离过程中慢慢地提高到操作线对应的浓度。并且单 位柱长的固定相利用率最高。

  1。需要找到比较合适的置换剂 2。不能分离不具备Langmuir分配等温线。色谱置换序列的监测需要与质谱法（如快原子轰击、电喷雾 离子化等）联用。不然只能先行收集然后再进行馏分分析

  一般置换剂中的杂质和固定相的亲和力都比置换剂小， 它们在分离过程中将污染被分离组分。因此就需要对置 换剂纯化。

  置换剂保留因子的测定：确保置换剂具有比样品所有组分更 大的保留能力； 置换剂浓度的确定：由于 • 流出组分的浓度随置换剂浓度增加而增加（操作线斜率减 小），而置换剂前沿的移动速度随置换剂浓度增加而加快。 • 置换剂以及样品在流动相中的溶解度限制了置换剂实际使 用浓度（使用高浓度置换剂将引起溶解度低的样品组分析 出）。 置换剂对组分污染的避免： • 按在置换序列中位置不同，组分可能被1—5％置换剂污染。 因此去除目标组分中的置换剂以及对置换剂的回收。为了 便于检测可以在置换剂分子中结合上发色基团或荧光标记

  例如：Freitag 设计了一种水溶性聚合物，聚合物组成不同有不 同的最低临界溶解温度（LCST）,当处于比LCST高的温度时聚 合物沉淀，温度不高于LCST时这种沉淀溶解反应非常迅速。因此 ，能够准确的通过置换剂的LCST使置换剂从流动相或从目标产物中除 去、回收利用。