色谱分析仪器ppt

  HPLC 中使用的检测器种类 1. 按检测器用途分类 ：检测器可分为通用型检测器（加和 性质）和选择性检测器（溶质性质）。 ? 通用型检测器是利用连续测定色谱柱流出物质某些具有普 遍性的物理参数如折光指数、介电常数等而设计的检测器。 根据吸馏液（样品与溶剂的混合物）与溶剂相同性质的差 别检测被分析物质。这种检测器具有广泛的适用性，但灵 敏度低，容易受外因如温度、流速、流动相组成等的 影响，因此限制了应用限制范围。 ? 选择性检测器是利用测定某些物质特有的性质如紫外吸收、 荧光等而设计的检测器，一般来说它的灵敏度要比通用型检 测器的灵敏度较高 10 2 ～ 10 3 倍或者更高，并且受外因包括 流动相的组成变化影响极小或者没有，但是在使用上仅限 于测定对检测器有相应的物质。 检测器 2. 按检测器测量性质分类 ：检测器可分为浓度型检测器 和质量型检测器。 ? 浓度型检测器是连续测定样品溶液的浓度变化，是反 映总体性质的检测器，例如紫外、荧光 或 示差检测器就属于此类。 ? 质量型检测器是测量样品的总量，库仑、同位素或质 谱检测器就属于这一类。 检测器 3. 按测量原理分类 ：检测器可分为光学检测器和电学检测器。 由于检测器是影响色谱中的薄弱环节，所以世界各国在研究 开发方面投入了大量的精力和财力。从目前发表的文献统计 数据分析来看，光学检测器（包括紫外、示差、荧光检测器等） 的应用占绝对多数，随着二极管阵列检测器的推广和应用， 这一比例还会增加。其次发展速度较快的是电学型检测器 （例如电化学、电导检测器等）。另外各国也正在积极地开 展 HPLC 与 IR 、 MS 、 NMR 等的联用技术。 检测器 HPLC 检测器的性能指标 ? 噪声与基线漂移 ? 灵敏度 ? 检测限（定量限） ? 线性范围 ? 定性定量重现性 ? 检测器的池体积 各类 HPLC 检测器介绍 紫外检测器（ UVD ） 紫外检测器是高效液相色谱仪使用最 广泛的一种检测器，它分为： 1. 固定波长紫外检测器 2. 可变波长紫外检测器 3. 光电二极管矩阵检测器 1. 固定单波长式紫外检测器 ? 光源：低压汞灯 ? 检测波长：固定于 254nm ? 灵敏、稳定、方便、经济 ? 检测器结构（可变波长检测器） 可变波长检测器采用氘灯作光源，波长在 190 ～ 600nm 范围可调。光源发出 的光经过透镜聚焦在入口狭缝上，光透过狭缝经过反射到达光栅，光栅把 190 ～ 600 范围的光分成不同波长的单色光后，把某一波长的单色光经过平 面镜反射至光分束器。透过分束器的光经过样品池最终到达样品光电二极 管检测器倍检测；被光分束器反射的光到达参比检测器被检测。紫外检测 器的这种设计，使得它在某一时刻只能采集某一特定波长。为了对色谱过 程中各个峰都获得最灵敏的检测，光栅可以编程控制，便于采集过程中变 化波长。 ? 紫外检测器适合使用的范围 紫外检测器不是通用型检测器，可以检测有 ∏ 键及非共用电子对的物质， 如烯烃，芳烃以及含 C ＝ O ， C ＝ S ， N ＝ O ， N ＝ N 基团的化合物，这些化合 物在紫外区都有吸收。 可变波长紫外检测器可以认为是微量流通池来代替紫外 / 可见分 光光度计的样品池。 ? 光源： D 2 灯 / W 灯 ? 检测波长： 185~400nm ， 或 400~600nm 任选 ? 灵敏、通用性更强 ? 当前 HPLC 仪配置最多的检测器 ? 不如单波长紫外检测器稳定 ? 噪音水平也相对较大 紫外检测器不是通用型检测器，可以检测有 ∏ 键 及非共用电子对的物质，如烯烃，芳烃以及含 C ＝ O ， C ＝ S ， N ＝ O ， N ＝ N 基团的化合物， 这些化合物在紫外区都有吸收。 3 . 光电二极管阵列检测器 DAD 与普通紫外检测器的不同之处在于进入流通 池的不是单色光，获得的信号不是在某一波长 上的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号。 因此，它不仅可进行定量检测，还能提供组分 的光谱定性信息。 赵龙山 分析化学教研室 一、液相色谱仪器 三、流程及主要部件 （一）高效液相色谱仪的组成部分 ? 贮藏罐与流动相脱气 ? 高压泵和梯度洗脱系统 ? 进样装置 ? 色谱柱与柱温箱 ? 检测器 ? 色谱数据处理系统 贮液罐与流动相脱气 ? 1. 贮液罐 ? 抵抗腐蚀能力 ? 0.5~2 L ? 高于泵体 ? 密闭 ? 溶剂经 0.45 μ m 滤膜除机械杂质 ? 输出流动相管路插入一端连接在孔径过滤器的贮 液瓶中 流动相 流动相选择 流动相前处理 - 过滤 流动相前处理 - 脱气 甲醇 乙腈 THF 缓冲盐 过滤： 0.45 μ m 或更 小孔径滤膜 目的： 除去溶剂中 的微小颗粒，避免 堵塞色谱柱，尤其 是使用无机盐配制 的缓冲液 脱气： 除去流动 相中溶解或因混 合而产生的气泡 ? 进样器：平头进样器。 ? 预柱：保护色谱柱。尤其是中药和生物样品，必 须使用。可以反冲。 ? 色谱柱：按照流动相流动方向安装。安装后检查 是否漏，用滤纸（观察柱压）。要观察废液缸流 出的流动相体积。 ? 检测器：按照要选择。 ? 记录系统：按照要选择。 高压输液泵及梯度洗脱装置 高压输液泵 要求： 1. 泵体耐腐蚀 2. 能在高压下持续工作 3. 输出流量范围宽 4. 输出流量稳定，重复性好 类型： 1. 恒流泵：输出恒定体积流量流动相 注射泵（螺旋泵） 柱塞式往复泵 2. 恒压泵（气动放大泵）：输出压力恒定，系统 阻力不变时流量恒定；系统阻力改变时流量不恒定。 高压输液泵可分为两类：恒流泵和恒压泵。 ? 恒压泵： 主要指气动放大泵，泵出口压力在系 统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。 ? 恒流泵： 包括往复柱塞泵和螺旋柱塞泵，这 类泵输出的溶剂流量是恒定的，柱前的压力由 柱后的 阻力及系统气密性决定。恒压泵和恒流 泵是指这两种泵的工作原理，并不表明泵的操 作方式。借助于电子控制电路，往复泵和柱塞 泵也可以按恒压方式操作。唯有气动放大泵只 能恒压操作。 三、高压输液泵 1. 气动放大泵 气动放大泵是根据压力传递原理而设计的。气 动泵有两个界面，气体推动的截面大，推动溶 剂的截面小。由于截面两端压力相等，则输出 截面的压强正比于两个截面的比值。只要这种 比值足够大，则输出的溶剂能够得到很高的压 力。 气动放大泵示意图 2. 往复柱塞泵 目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复柱塞泵。在电机驱动下，柱塞杆 在泵头内作作线性往复运动，完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程。 (1) 工作过程 ? 在吸液过程中，由于柱塞的运动而在泵腔内形成负压。此时由于色谱柱的 存在，泵头外的压力显然高于泵头内，在这种情况压差下，出口单向阀的 宝石球落回到阀座上；而入口单向阀因为外界大气压大于泵腔内的压力， 宝石球离开阀座，流动相顺利地进入泵腔 ? 在输液过程中，由于柱塞杆的运动使压力增加，入口单向阀的宝 石落回到阀座，入口单向阀处于关闭状态；当泵头的压力继续增 加，并且超过了泵头外的色谱柱的反压时，出口单向阀开启，流 动相输出。 (2) 往复柱塞泵的特性 ? 往复柱塞泵每往复一次输出的流量由柱塞的截面积和冲程决定。单位 时间输出的液体流量由单位时间内柱塞往复的次数决定。 ? 往复泵可以连续不断的以恒定的流量输送液体，同时更换溶剂非常方 便，非常适合于梯度洗脱的需要。 ? 往复泵的缺点在于柱塞是往复运动地，输出流量和泵压力有波动性。 在系统压力过高时有反吸现象。 (3) 多头往复泵 为降低液体输送过程中所产生的脉动，最有效的方法是采用多头往复 泵，由专门设计的驱动装置保证在任一瞬间都有液体输出，以降低波 动。 双柱塞往复串连泵 (HP 1100) 双柱塞往复并联泵 (HP1090) (4) 四元泵（单元泵）（ HP1100 ） 四元泵（单元泵）属于双柱塞往复串连泵。四元泵启动时，通过运 行一个初始程序来决定第一个活塞能到达的最高位置。第一个活塞 慢慢向上移动至最高位置，然后从那向回移动一个预定的路径长度。 控制器将这个活塞位置存贮在记忆中。完成初始化后，泵开始设定 参数的操作。主动阀打开，向下移动的活塞将溶剂吸入第一个泵头， 与此同时，第二个活塞向上移动，将溶剂送入系统。在完成一个由 控制器决定的冲程长度后，驱动马达停止，主动阀关闭。马达反方 向反转，移动第一个活塞向上至最高位置，同时移动第二个活塞向 下。 (5) 二元泵 二元泵是指一个泵腔内含有两个相同的泵，它通过高压混 合产生梯度，二元泵不包括真空脱气装置，但真空脱气机 可当作单独的产品定购，在需要最好的流动稳定性时使 用，特别是在低流速或最大检验测试灵敏度时。 二元泵中每个泵的工作原理与四元泵（单元泵相同） 3. 螺旋柱塞泵 因其工作原理与注射器类似，也称为注射泵。 螺旋柱塞泵和往复泵的原理完全不同。电机以一定的转速通过 螺杆旋转驱动柱塞上下移动。柱塞向下移动时，将液体吸入缸 内，一次吸入数十毫升，可快速进行。柱塞向上移动时将液体 排出。流量通过电机转速控制。 1 2 3 4 5 6 7 1 －溶剂出口 2 －三通阀 3 －溶剂入口 4 －溶剂室 5 －活动密封 6 －螺旋推动柱塞 7 －转速驱动装置 梯度洗脱装置 梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不 同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流 动相组成，以调节流动相极性。 梯度洗脱技术的优点是 : 可提高柱效、缩短分析时 间，也可改善检测器的灵敏度。当样品第一个组 分的 k 和最后一个峰的 k 相差几十倍至百倍时，采 用梯度洗脱效果最好。此技术与气相色谱法中的 程序升温相似。 梯度洗脱方式有两种：低压洗脱和高压洗脱 ? 低压梯度洗脱系统： 常压下将溶剂按程序混合，用一台高压泵 送入色谱柱 ? 高压梯度洗脱系统： 两台高压泵将溶剂增压后送入梯度混合室 混合，再送入色谱柱 四、梯度洗脱装置 根据溶剂混合的原理不同，梯度洗脱 装置可分成两类：低压梯度和高压梯度 1. 低压梯度洗脱（泵前混合） 低压梯度：溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵 把混合液输送至系统中。方法简单、 经济，而且只 需一个泵，所用溶剂元数没有限制（一般最多为四元）。 2. 高压梯度（泵后混合） 高压梯度：溶剂首先经过高压泵加压，然后在混合室 内混合。高压梯度通常用两台高压输液泵，每台输 送一种溶剂。 进样系统 在液相色谱中，进样方式有三种：柱头进样，六通阀 进样，自动进样。 三种进样方式中，最理想的进样方式是柱头进样，但 由于实践起来困难很大，因此在常规分析中主要是采用 六通阀进样或自动进样。 一、六通阀进样 2. 自动进样器 自动进样器是由计算机自动控制定量阀， 按标准编制注射样品的操作程序工作。取 样、进样、样品管路清洗和样品盘的转动 均按预定程序自动进行，一次可进行上百 个样品分析。 2. 自动进样器 Mainpass Bypass Loading Inject and Run 柱材料及规格 1. 柱材料：内壁抛光的不锈钢管 2. 柱规格：直型。内径 4.6mm 或 3.9mm ；长 度 10~50cm 柱温控制 用柱温箱控制柱温。 色谱柱 色谱柱的测试与维护 商品柱都附有测试条件和报告。 色谱柱使用的过程中的需要注意的几点 （ 1 ）仪器与柱子连接时，不要用力过大。 （ 2 ）进样前，样品要处理。 （ 3 ）更换流动相时，根据流动相性质选择正真适合 的溶剂冲洗仪器和色谱柱，防止流动相不相 溶或盐析出，堵塞柱子。 （ 4 ）柱子存放过程应密闭，防止固定相干燥， 定期冲洗。 色谱柱的选择 色谱柱的使用 1. 流动相：高纯度、过滤、 pH 范围、 有机溶剂与色谱柱 匹配 互溶、并能溶解样品 2. 净化样品 3. 使用保护柱：与色谱柱填料、内径一致避免色谱柱污染 ※ 拧三圈！退一圈！ （二）检 测 器 检测器是高效液相色谱仪中的三大部件之一 （高压输液泵、色谱柱、检测器），大多数都用在 检测经色谱柱分离后的组分浓度变化。 检测器应具备如下特征： ①灵敏度高 ②对组分的响应速度快 ③响应对流动相流量和气温变化不敏感 ④不引起柱外峰展宽 ⑤线性范围宽；使用范围广 检测器 检测器的作用是将从色谱柱中流出的物质量的变化， 转变成可供观测或检测的信号，通常为电压信号。该信 号再通过记录仪、积分仪或色谱工作站等进行色谱数据 处理。 对于液相色谱而言，由于待分离样品的所有组分均 溶于流动相中而处于液相状态，样品与样品、样品与流 动相之间各种物理性质接近，因此要寻找出一种即通用 又灵敏的检测的新方法很难，至今为止检测器的技术问 题仍然是 HPLC 中的薄弱环节。

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