色谱学导论（仪器分析）ppt

  茨维特实验（动画m4-1-1.swf） 样品 载液 2.1.3 色谱分类方法： A. 按固定相外形分： 柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱） 。 B. 按组份在固定相上的分离机理分： 吸附色谱(adsorption chromatography): 不同组份在固定相的吸附作用不同； 分配色谱(partition chromatography)： 不同组份在固定相上的溶解能力不同； 离子交换色谱(ion-exchange)： 不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同； 凝胶色谱（尺寸排阻色谱 gel chromatograhy）： 不一样的尺寸分子在固定相上的渗透作用。 § 2.2 色谱学基本概念 差速迁移：不同组分通过色谱系统时移动速度不同，各组分通过色谱柱的速度，取决于其在色谱体系中的平衡分布。影响平衡分布的因素：流动相和固定相的性质、色谱柱温等。 分子离散：指同一化合物分子沿色谱柱迁移过程中发生分子分布扩展或分子离散。这种差别来源于流体分子运动的速率差异。 2）峰高： 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。 3) 色谱峰面积(peak area) 色谱峰面积就是色谱曲线与基线间所包围的面积，即图中CBD内的面积。 4) 色谱峰区域宽度(peak width) 注意： r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关。具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值，此时以? 表示： ? 1, 又称选择因子(Selectivity factor)。 色谱图 chromatogram色谱峰 chromatographic peak峰底 peak base峰高 h， peak height峰宽 W， peak width半高峰宽 Wh/2，peak width at half height峰面积 A， peak area拖尾峰 tailing peak前伸峰 leading peak假峰 ghost peak 鬼峰是指在整个色谱分析和样品处理过程中带入的杂质，在检测步骤时产生吸收从而在图谱上反映出来的未知峰（本不应出现在图谱中）  畸峰 distorted peak反峰 negative peak拐点 inflection point原点 origin 正相液相色谱法 normal phase liquid chromatography 反相液相色谱法 reversed phase liquid chromatography，RP 柱液相色谱法 liquid column chromatography 高效液相色谱法 high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法 size exclusion chromatography，SEC 凝胶过滤色谱法 gel filtration chromatography 凝胶渗透色谱法 gel permeation chromatography，GPC 亲和色谱法 affinity chromatography 离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC 离子色谱法 ion chromatography 离子抑制色谱法 ion suppression chromatography 离子对色谱法 ion pair chromatography 疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography 制备液相色谱法 preparative liquid chromatography /Blog/u/7/archives/2007/2.html 色谱图的基本特征： 在适当的色谱条件下，样品中每个组分均有相应的色谱峰，色谱峰一般呈对称的高斯曲线。 如果连续的色谱峰其中一个峰的半高宽度不规则增大，则可能该色谱峰中有一个以上组分。 色谱峰的区域宽度与组分的洗出时间(即保留时间)一般呈线性关系。峰半高宽度或峰底宽度随组分保留时间呈线性增加。 色谱图是色谱分析的主要技术资料。色谱图应标明色谱流动相、固定相、操作条件、检测器的类型和操作参数，样品类型及有关说明等。 §2.3 色谱法基础原理 tR=t0(1＋k)→推导过程见下： 若流动相（载气）在柱内的线速度为u，即一段时间里载气在柱中流动的距离（单位cm·s-1)，由于固定相的作用（保留），所以组分在柱内的线速度us将小于u，则两速度之比称为滞留因子（retardation factor）Rs. 讨论： ?：固定相颗粒使分子扩散受阻，因此降低扩散程度 分子量大的组分， Dg 随柱温升高？？？，随柱压降低而？？？； 流动相分子量大， u 增加， 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可勿略。 讨论： 分离度、柱效和选择性参数的联系： 3）分离度R与分配比k的关系 The larger, the better to R k 1 3 5 7 9 11 13 ∞ k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00 When k10，k/(k+1) is changing slowly，in fact, it need too much time. So the best choice is 1k10。 作业： P60-P61：3、4、20、21、22 4) 样品量的影响 每一个色谱柱固定相，都有一定的样品线性容量范围，在该范围内，进样量增加．色谱峰高增加，色谱峰区域宽度和保留时间不变。 对多组分混合物，分离时间即为最后一个组分的保留时间。 由以下三式： 得到 可见，分析时间与R，?，k、H/u等参数有关。 2.4.4 分析时间 t 概念、表示方法及计算公式汇总 表-1 表-2 习题 两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。 试计算： 1）柱分离度R； 2）柱平均理论塔板数nav 3）平均塔板高度Hav 4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？ 5）使用上述较长的柱做多元化的分析时，其分析时间为多长？ 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？ 1） 2） 3） 4） 解： 5） 6） 2.3.1、描述分配过程的参数 分配系数(Distribution constant,) K ： 描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。 (2-8) 分配比(Retention factor or capacity factor, k)： 又称容量因子。表示一个组分在固定相中停留的时间是不保留组分保留时间的几倍。 其中Vm 色谱中流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积。 Vs 为固定相体积。 分配比 k 的求算：k = (t r – t 0 ) / t 0 = t?r / t 0 = V?r / V 0 (2-9) (2-10) Rs=us/u （2-11） Rs可用质量分数ω表示： 组分和流动相通过长度为L的色谱柱所需时间分别 K 与 k 的关系： 选择因子? ：色谱柱对A、B 两组分的选择因子? 定义如下： A为先流出的组分，B为后流出的组分。 ? 与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，而与柱尺寸、流速、填充情况无关 (2-17) 1. 塔板理论（Plate theory) 塔板理论假定： 1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。 当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。 H 2.3.2 峰间距、峰形状和峰宽的理论描述 2. 速率理论（Rate theory,也称范.弟姆特方程式） A—表示涡流扩散系数； B—分子扩散系数； C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。 1）涡流扩散项(Multipath term, A) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”.展宽程度以A表示： A=2?dp 其中dp—填充物平均直径；?—填充不规则因子。 可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。 2）分子扩散项(Longitudinal diffusion term, B/u) 也叫纵向扩散相。它是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为 B=2?D ? —称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况； D—组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示； 球状颗粒； 大分子量流动相；适当增加流速； 短柱； 低温。 Dg小，即B小 Dg 小，即 B 小 组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u） 3）传质阻力项(Mass-transfer term, Cu) 因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，产生峰形展宽。 a）气液色谱：气相传质阻力系数Cs和液相传质阻力系数Cl。 流动相 固液界面 固定液 组分分子 Cl Cg 讨论： 减小填充颗粒直径dp； 采用分子量小的流动相，使Dg增加； 减小液膜厚度df，Cl下降。 增加柱温，可增加Dl，但k值也减小，为保持合适Cl值，应控制柱温。 b）液液色谱：流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs 讨论： 流动相传质阻力包括两方面： 流动的流动相中的传质阻力Cm和滞留的流动相传质阻力Cs 。 与填充物大小 dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。 方法：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。 固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散系数Ds等有关。 ?sm ?涡流扩散项A与流速u无关； ?低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导， 此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可 减小扩散，提高柱效； ? 高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导， 此时选择分子量小的气体如H2和He为载气， 可增加扩散系数，提高柱效； ? 曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的 最小板高Hmin( )； ? LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获得比较大的柱效。 4）流速u 由van Deemter方程 H = A + B/u + Cu知道： 当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。 以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到： 板高，H(cm) Hmin A+B/u+Cu Cmu Csu A B/u 5）固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！ 但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。 板高, H(cm) § 2.4 分离度及色谱分离方程 2.4.1 分离度(Resolution, R) 分离度是定量描述相邻两组分在色谱柱内分离情况的指标。同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。定义为： 利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。 R 越大，相邻组分分离越好。 色谱分离中的四种情况的讨论： ① 柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离； ② △K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； ③柱效较低，，△K较大,但分离的不好； ④ △K小，柱效低，分离效果更差。 R=1.5 R=0.75 R=1.0 响应信号 保留时间 t/ min R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准） 2.4.2 分离度方程 R 的定义并未反映影响分离度的各种各样的因素： 柱效n、选择因子? 和保留因子 k 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设k1?k2=k，W1 ? W2=W。因此可导出R与n（neff）、? 和 k 的关系(P77): 附：具体推导过程如下： 1）分离度R与柱效n的关系 对具一定相对保留值?的物质对，R与有效塔板数neff有关，由色谱方程可得： 因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！ 为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。 2.4.3 有关色谱方程的讨论： 2）分离度R与保留因子?的关系 ?代表两个溶质在色谱条件下的分离选择性。 若? ＝1，两组分不可能分离； ? 略大于l，就可能实现分离。 ? 越大，柱选择性越好，对分离有利。 气相色谱主要是通过选择正真适合的固定相和降低柱温来提高?值; 液相色谱，改变固定相和流动相性质，均能提高?值，一般会用改变流动相的组成和极性来提高?值。 ∞ 1450000 367000 94000 16000 4400 900 320 145 R=1.5 R=1.0 ∞ 650000 163000 42000 7100 1900 400 140 65 1.00 1.005 1.01 1.02 1.05 1.10 1.25 1.50 2.00 N有效 ? 气相色谱采用改变固定相和固定相用量来调节k； 液相色谱主要是通过改变流动相组成，即控制溶剂强度来调节k，欲增加k值，则降低溶剂强度；反之欲降低k，则增加溶剂强度。 分离沸点或极性相差很大的多组分混合试样，气相色谱采用程序升温、液相色谱采用梯度淋洗，调节合适的k值范围。 溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响 1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌 4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌； 70%CH3OH +30H2O 60%CH3OH +40H2O 50%CH3OH +50H2O 40%CH3OH +60H2O 改变流动组成 使 k 最佳 色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际在做的工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决这一个问题。 * * 第二章 色谱分析方法导论 1 概述 历史、色谱分离过程、分类 2 色谱学基本概念 色谱图及相关术语 3 色谱法基础原理 描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述(塔板理论及速率理论) 4 分离度及色谱分离方程 分离度及色谱分离方程、影响分离的因素 化学分析方法的基础要求是其选择性要高。即：在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最重要的步骤！ 20 世纪中期：大量采用一些经典的分离方法：沉淀、 蒸馏和萃取 现代分析中：大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。 § 2.1 概述 Generalization of chromatographic method 2.1.1 色谱法由来: 1903年，俄国植物学家Mikhail Tswett 最先发明 色谱柱 流动相 固定相 色谱法 2.1.2 色谱分离基础原理： 当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同次序从固定相中流出。 与适当的柱后检测的新方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 检 测 器 色谱图 C. 按两相状态分 超临界液体和键合相间的分配 有机组分键合于固体表面 超临界流体 不相溶液体间的分配 吸附 液体和键合体表面间的分配 离子交换 分配/筛析 液体吸附于固体 固体吸附剂 有机组分键合于固体表面 离子交换树脂 液体附于多空聚合物 液液色谱 液固（吸附）色谱 液相键合色谱 离子交换色谱 凝胶渗透（尺寸排阻）色谱 液相色谱 气液间分配 吸附 气体和键合体表面间的分配 液体吸附于固体 固体吸附剂 有机组分键合于固体表面 气液色谱 气固色谱 气相键合色谱 气相色谱 平衡类型 固定相 方法 分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。 D. 按照展开程序分类 洗脱法也称冲洗法。 首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。 顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。 A B 迎头法:将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。 该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。 样品本身就是流动相 色谱过程是多组分混合物在流动相带动下通过色谱固定相，实现各组分分离。 样品在色谱体系或柱内运行有两个基本特点： 混合物中不同组份在柱内的差速迁移(differential migration)； 同种组份分子在色谱体系迁移过程中分子离散(spreading)。 2.2.1 色谱流出曲线（色谱图chromatogram） 混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应 色谱图是柱流出物通过检测器产生的响应信号对时间或流动相流出体积的关系曲线图。它反映分离的各组分从色谱柱洗出浓度随时间的变化，从一个侧面记录组分在柱内运行的情况。 1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大的、稳定的基线应该是一条水平直线，如图中CD线。 基线漂移(Baseline drift):指基线随时间的缓慢变化； 基线噪声(Baseline noise):指由各种各样的因素所引起的基线起伏。 单一组分色谱图 2.2.2 色谱术语 用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差(?)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 ? （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 ? 信号 进样 t0 5）保留值(Retention value, R) （定性参数） 表示试样中各组分在色谱柱中的滞留时间的数值。 组分在色谱系统中的保留值，有三种描述方法： 第一，用时间描述组分保留行为的参数； 第二，用流动相的体积描述组分保留行为的参数； 第三，用相对值描述组分保留行为的参数。 死时间(Dead time, t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。据 t0 可求出流动相平均流速，如下图。 (2-1) b. 保留时间tr ：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间tr’。 信号 tr t0 进样 c. 调整保留时间 ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即 (2-2) 由于时间为色谱定性依据，但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 d. 死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到： (2-3) 其中，F0为柱出口的载气流速（mL/min) e. 保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 Vr= tr· F0 (2-4) f. 调整保留体积Vr’ ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。 (2-5) g. 相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。 (2-6) (2-7) 前伸峰 a、d 拖尾峰 b、c 分叉峰 e “馒头”峰 f 鬼峰？？？ 拖尾因子：用以衡量色谱峰的对称性。0.95~1.05 斑点 spot区带 zone复班 multiple spot区带脱尾 zone tailing 由于物理、化学等作用的影响，一种 组分在展开后形成的彗星形状斑点。 基线 base line基线漂移 baseline drift基线噪声 N，baseline noise 液相色谱法 liquid chromatography，LC液液色谱法 liquid liquid chromatography，LLC液固色谱法 liquid solid chromatography，LSC 色谱流出曲线的意义： 色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱 柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相 选择是否合适的依据。

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